布鲁氏菌抗体高特异性检测方法的研究--结题验收

项目成果简介（3000字以内，包括项目实验成果、创新性、应用情况等）：

1、在国家统计源（科研核心）《中国生物制品学杂志》发表论文一篇：

牛布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及纯化 梁晓英 中国生物制品学杂志2009-08

2、建立起ELISA检测试剂盒

将纯化的L7/L12蛋白稀释到20ng/mL后包被酶标板，用被检动物血清1：100稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG 1：2000稀释作为二抗。同时检测确认感染动物及阴性对照。将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。

经ELISA检测结果显示，本实验建立的ELISA检测方法可以检测出已感染布鲁氏菌的牛。

试剂盒的组装过程如下：

(1)把L7/L12蛋白稀释到20ng/mL,包被ELISA板，用保鲜封好。

(2)配制PBS高压灭菌后分装。

(3)酶标鼠抗牛抗体稀释后分装灭菌瓶中

(4)布鲁氏菌灭活阳性对照血清1/200稀释后，分装。

(5)阳性对照血清。

（6）把以上试剂分装后，装入试剂盒中。

3、组装成布鲁氏菌的免疫胶体金试纸条

在氯金酸和柠檬酸三钠条件一致的前体下，选用电炉直接加热法、水浴锅加热法和微波炉加热法制备金溶胶，并与购买的商品化的金溶胶比较。从实际操作过程及烧制结果的稳定性来看，微波炉加热法为最优。

采用15 nm、25 nm、30 nm、40 nm四种粒径胶体金制备的探针，均匀涂抹在处理后的玻璃纤维膜上制成金标垫。比较四种粒径胶体金制成的金标垫：25 nm的金标垫颜色为均一的红色，探针分布均匀，4℃保存时间长，性质稳定。因此，本实验选择25 nm的金标垫制作试纸条。

经试验比较三种型号的硝酸纤维素膜（Sartorius CN140，AE99，Immunopore RP），金标在没有包被T线和C线的膜上的扩散情况以Sartorius CN140为优，故选择硝酸纤维素膜Sartorius CN140作为反应膜。

对NC膜上T线及C线设置几组抗体浓度梯度选择出最优的一组作为金标浓度（T线）和包被浓度（C线）。当T、C线的浓度过高或喷膜量过大时均出现不同程度的拖带，而T、C线的浓度过低或喷膜量过小时出现条带显色不清晰和拖带现象。经试验验证比较，按1.0µL/cm的喷膜量进行喷膜时，效果最好。

按试验要求组装试纸条，切割成规定的尺寸（约3.5mm），将成品装入锡箔袋或者制成检测卡。加样10～15min后判定结果，根据T线、C线的显色条带判定样品为阳性、阴性或者是试纸条失效。

将经过灭活和适当稀释的感染布鲁菌牛血清（广泽乳业提供）滴加在试纸条加样区，3min后，检测线和质控线均显示为红色，能很好的鉴别牛血清。同时，我们还进行了特异性实验、重复性实验及样本检测。