ZkU吉林大学动物科技实验教学中心
吉林大学“大学生创新性实验计划”项目
进 展 表
项目编号 2008A02
项目名称布鲁氏菌抗体高特异性检测方法的研究
项目负责人 吴 威
所在学院 畜牧兽医学院
指导教师姓名 闫广谋 李颖 张英 赵云
填 表 日 期 2008 年 11 月25 日
吉林大学动物科技实验教学中心
项目名称
布鲁氏菌抗体高特异性检测方法的研究
项目基本信息
项目等级
学院
项目经费
自筹
项目起止时间
2008.05~2009.05
项目负责人
吴威
联系电话
13578912469
E—mail
Wuwei19860326@163.com
项目参加人
赵娜、梁晓英、王贤平、罗世芬、郑经成、胡丹、张阳阳
指导教师
闫广谋 李颖 张英 赵云
13843040069
项目进展情况及取得的阶段性成果：
本课题从2008年3月份开始查阅文献，4月中旬撰写了申请资料，经辅导老师修改审定后，撰写了开题报告，5月份经过审批正式被动物科技实验教学中心立项，同时开始了本课题的实验。按照开题报告的计划，已进行了近6个月的实验（中间因北京奥运会安检安求停止了3周）。目前，该项目进展基本顺利。以下是该项目取得的阶段性成果。
1、布鲁氏菌全基因组DNA的提取
将布鲁氏菌S19接种于5mL肝汤液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养72 h，收集细菌，按细菌基因组提取试剂盒操作说明提取细菌全基因组。
2、目的基因PCR的扩增
设计一对引物，利用PCR，以布鲁氏菌基因组为模板，对L7/L12基因进行扩增:95℃预变性 4 min；94℃ 变性2 min, 60℃ 退火75s，30C；72℃延伸60s。然后用1% 琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。
L7/L12基因电泳图
3、基因的克隆鉴定与表达载体的构建
将回收的PCR产物链接到载体pMD-18T上，转化到大肠杆菌扩增，挑取阳性克隆，酶切鉴定、测序。将测序正确的质粒双酶切，凝胶回收，用T4连接酶使回收产物与载体pET-28a相连, 构建重组质粒，然后把重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含Kan的琼脂平板上,37℃培养过夜。次日挑取阳性克隆菌落，扩大培养，提取质粒，经酶切鉴定后，命名为pET-L7/L12。
pMD- L7/L12电泳鉴定图
基因序列比对图
pET-L7/L12电泳鉴定图
4、基因的诱导表达及纯化。
把重组质粒pET-L7/L12转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆，培养到OD600=0.38时，加入IPTG到最终浓度1mmol/L，分别诱导2小时、3小时、4小时，观察L7/L12蛋白在大肠杆菌BL21中表达情况，分析认为诱导4个小时的表达量最高。
将待纯化的样品加到金属鳌合的柱中，并以最佳流速让其流过柱床。加入结合缓冲液，把其它蛋白洗掉，再加入洗脱缓冲液，将L7/L12洗脱，经SDS-PAGE分析纯化的L7/L12蛋白可见只有一条带，凝胶薄层扫描分析纯度为89%。
纯化蛋白，诱导表达，空白对照图
5、重组L7/L12蛋白间接ELISA方法的建立
（1）小鼠血清的制备
用布鲁氏菌接种4只小鼠，再用其它细菌接种4只小鼠，15天后断尾取血，而后制备血清。
（2）ELISA检测方法的初步建立
将纯化的L7/L12蛋白稀释到20ng/mL后包被酶标板，用被检动物血清1：100稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 1：200稀释作为二抗。同时检测确认感染动物及阴性对照。将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。
ELISA检测的结果
抗原稀释的倍数
4只接种布鲁氏菌的小鼠血清
PBS对照
4只接种其它细菌的小鼠血清
1
2
3
4
200
2.671
2.284
2.261
2.654
0.080
0.262
0.474
0.674
0.297
400
2.165
1.918
1.900
2.148
0.090
0.171
0.267
0.316
0.182
800
1.336
1.437
1.420
1.326
0.077
0.122
0.143
0.173
0.159
1600
0.997
1.063
1.049
0.992
0.084
0.098
0.106
0.119
3200
0.645
0.660
0.653
0.639
0.068
0.082
0.091
0.102
0.095
6400
0.329
0.445
0.437
0.325
0.092
0.071
0.076
0.096
12800
0.258
0.315
0.310
0.255
0.0083
0.066
0.075
25600
0.178
0.196
0.193
0.176
0.103
0.064
0.083
0.070
0.085
6、ELISA试剂盒的组装
(1) 把L7/L12蛋白稀释到20ng/mL,包被ELISA板，用保鲜膜封好。
(2) 配制PBS高压灭菌后分装。
(3) 酶标鼠抗牛抗体稀释后分装灭菌瓶中
(4) 布鲁氏菌灭活阳性对照血清1/200稀释后，分装。
(5) 阳性对照血清。
（6）把以上试剂分装后，装入试剂盒中。
组装的试剂盒
组装试剂盒中的试剂
负责人签字：
年 月 日
经费使用情况：
质粒提取试剂盒1个 350元
DNA提取试剂盒1个 350元
DNA MarK 2000 1支 200元
DNA引物合成 180元
购置冰箱一台 1520元
管理教师（签字）：
存在的问题及拟采取的措施：
存在问题：L7/L12蛋白纯化精度不够高，所组装试剂盒保质期没有预期长。
拟采取的措施：换新的方法纯化蛋白，在试剂盒中加入蛋白酶K，以防蛋白变性带来不利的影响。
下一阶段工作计划：
1、修改现已完成的科研论文一篇，在结题前再撰写一篇科研论文。
2、补充实验，进一步优化实验条件，检测组装试剂盒的质量与质期。
3、进一步研究先进的检测方法。
4、把试剂盒初步试用于教学上。根据试用情况，修改条件，最后应用于教学。
5、在试用于教学的基础上，逐步申请中试。
指导教师意见：（应对项目组成员工作态度、项目进展情况、存在问题等方面提出具体意见）
课题组所有成员的积极性高，主动参与实验操作的意识强，充分利用节假日、课余时间到实验室进行实验的精神值得发扬。经过近半年的努力，已经取得了阶段性成果，达到了预期目的。
由于课题组所有成员都是初次参加创新实验，其严谨的作风和科学的态度不够，在实验中发生过多次失误，其中最严重的失误，是把构建的工程菌株在传种保存中丢失，影响了创新实验进程。在以后的课题进程中，要加强工作态度的培养。
指导教师（签字）：
实验中心意见：
该项目对于本科生来说，具有一定的难度。但是，课题组的同学们在老师的指导和帮助下，克服了很多困难和失败，完全利用课余时间和节假日，在近半年的时间里，基本完成了预期的目标，取得了可喜的阶段性成果。希望同学们在前阶段实验的基础上继续努力，充分发挥自己的聪明才智，争取圆满完成本课题的所有实验任务。
中心主任（签字）：
上一条：布鲁氏菌抗体高特异性检测方法的研究-创新实验中期检查PPT
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